Выполнен анализ чувствительности безразделительной схемы иммуноанализа с использованием функционализированных магнитных наночастиц (МНЧ) и чувствительного ВТСП СКВИД-магнитометра. Сигнал от образца объемом 100 мкл с концентрацией 1 мг/мл в поле 7.5 нТл составил 20 мФ_0. При полосе усреднения 1 Гц для СКВИДа с уровнем шума интерферометра 1х10^{-5} Ф_0/Гц^{1/2} отношение сигнал/шум равное 1 будет получено в разовом измерении без накопления сигнала при концентрации 0.5 мкг/мл, что позволяет получить чувствительность в диапазоне 50 нг/мл при временных затратах в 100 с на точку в частотном спектре.
87.83.+a Biomedical applications of nanotechnology
75.75.Jn Dynamics of magnetic nanoparticles
^1Московский государственный университет имени М.В Ломоносова, физический факультет, кафедра физики полупроводников\
^2Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»\
^3Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Научно-исследовательский институт ядерной физики имени Д. В. Скобельцына\
^4Технологический университет Чалмерса, факультет микро- и нанотехнологий. Швеция, SE 412 96, Гетеборг.
Настоящая работа выполнена в рамках проекта, направленного на создание методики и аппаратуры для реализации безразделительной схемы иммуноанализа с использованием функционализированных магнитных наночастиц (МНЧ) и чувствительного магнитометра.
Большинство методов иммуноферментного анализа включают стадии разделения иммунореагентов, а затем отмывки непрореагировавших иммунокомпонент. Безразделительный анализ без отделения свободных антигенов от связанных с антителами позволяет значительно сократить время его проведения. Однако выделение сигнала от связанного с антителами материала на фоне несвязанного требует использования высокочувствительного регистрирующего прибора, каким и является сверхпроводящий квантовый магнитометр --- СКВИД.
В последнее время для изучения молекулярных механизмов взаимодействия нуклеиновых кислот (НК) с белками, а также для многих других целей широко применяются аптамеры --- небольшие молекулы, способные выполнять функции высокоспецифичных рецепторов органических соединений различной природы. Аптамеры представляют собой однотяжевые молекулы ДНК/РНК длиной 40--100 нуклеотидов с достаточно сложной трехмерной структурой [1]. Именно структура аптамеров обеспечивает их способность к специфическому связыванию с целевыми белками. Для отбора (селекции) высокоспецифичных аптамеров используется метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment), который был разработан в 1990 г. [2].
Комплексы аптамер--белок могут успешно заменять комплексы антиген--антитело в иммунодиагностических методах, так как константы диссоциации комплексов для тех и для других лежат в наномолярной области, а для ряда комплексов аптамер--белок эта величина снижается до пикомолярных величин, что свидетельствует о высоком сродстве взаимодействующих молекул. В разрабатываемом в данном проекте методе СКВИД регистрирует изменение частоты броуновских колебаний магнитных наночастиц при связывании их в кластеры с аптамерамии искомыми белками.
Общая схема эксперимента описывалась ранее [3,4,5] и в упрощенном виде представлена на рис. 1. Цилиндрическая ампула радиуса R_a, заполненная до некоторой высоты h анализируемой жидкостью, содержащей биологически функционализированные магнитные наночастицы, находится над сверхпроводящим квантовым магнитометром на основе оксидных пленок (ВТСП СКВИД) с входными приемными петлями в градиометрической конфигурации для фильтрации пространственно однородного поля внешних помех.

При этом ампула находится при комнатной температуре 300 К, а ВТСП СКВИД, наклеенный на сапфировый стержень --- при температуре, близкой к 77 К. Расстояние между дном ампулы и СКВИДом определяется толщиной стекла и вакуумного зазора, отделяющих СКВИД от комнатного пространства, и равно z_a. Для определенности будем считать, что СКВИД с приемными петлями с размерами W и lW по соответствующим осям, где l --- произвольное число, лежит в плоскости {z=0,} внешнее магнитное поле H_\textrm{ext} приложено вдоль оси y и однородно в объеме ампулы, начало координат находится в центре градиометра.
Поскольку вклады в магнитный поток, связанный со СКВИД, от наночастиц, находящихся в различных точках ампулы, различны, выделим в жидкости-аналите капли, малые по сравнению с объемом ампулы. Пусть в ампуле, в точке r_0 с координатами (x_0,y_0,z_0) находится некоторое количество магнитных наночастиц, которые на первом этапе оценок заменим единичной сферической каплей с радиусом R. Выберем значение R много меньшим размеров R_a, h и приемных петель градиометра W и lW, но много большим размеров наночастиц. В таком приближении можно считать намагниченный внешним полем образец с радиусом R точечным диполем, но при этом использовать характеристики находящегося в нем ансамбля наночастиц, в первую очередь магнитную восприимчивость, необходимую нам для оценки величины сигнала СКВИД
Параллельное соединение петель градиометра приводит к тому, что в интерферометр СКВИДа, связанный с общим проводом петель градиометра гальванически (автотрансформаторная схема) или магнитно (трансформаторная схема), заводится часть разности потоков, создаваемых в них образцом, намагниченным внешним полем [6,7]. При симметричном расположении капли относительно плоскости {y=0} потоки в петли градиометра имеют противоположные знаки и в общем проводе градиометра токи петель суммируются. Нужно иметь в виду, что в этом случае ток в общем проводе в два раза больше, чем при калибровке чувствительности прибора тем же полем с разрывом одной из петель [8] или с использованием катушки, задающей поле в одну из петель градиометра [9].
Разность магнитных потоков от ампулы с аналитом можно выразить через значения компоненты поля H_z от единичной капли, усредненные по каждой из петель и по положению капли в ампуле:
где A=lW^2 --- площадь обеих приемных петель градиометра; n(r_0) --- плотность капель в ампуле, константа в данном приближении.
При вычислении вклада от рассматриваемого образца с радиусом R в величину \langle H_z\rangle_V будем считать, что она парамагнитна, имеет сферическую форму и однородно намагничивается, так что поле от нее может быть представлено в виде поля магнитного диполя:
где \chi --- объемная магнитная восприимчивость ансамбля наночастиц в капле.
Будем рассматривать СКВИД с прямоугольными приемными петлями с размерами lW и W (l --- число, характеризующее отношение сторон петли) по осям x,y с началом координат в центре контура, как показано на рис. 1. Очевидно, компоненты вектора \vec{H}_\textrm{ext} в выбранной системе координат имеют вид \{0,H_\textrm{ext},0\}. Нас будет интересовать z поля H_z от образца, поскольку именно она создает магнитный поток в приемные петли градиометра СКВИДа. Для дальнейших расчетов введем нормированные переменные

В нормированных по аналогии с величинами в выражении (3) переменных усредненное (интеграл по площади в выражении (1)) нормированное магнитное поле от капли, расположенной в точке с координатами (x_0,y_0,z_0), действующее на градиометр, может быть записано следующим образом:
На рис. 2 показан результат расчета поля в пакете MathCAD по формуле (5) в случаях z_0=0.1, 0.25, а внизу серой плашкой для наглядности показана площадь, занимаемая градиометром. График на рисунке фактически показывает суммарный нормированный поток в петли градиометра в зависимости от положения капли --- источника этого поля --- в пространстве. Координаты капли задаются через вектор \widetilde r_0=(\widetilde x_0,\widetilde y_0,\widetilde z_0), а усреднение идет по координатам \widetilde x,\widetilde y.
Из графиков, приведенных на рис. 2, видно, что при увеличении расстояния капли от плоскости СКВИДа и смещении ее в плоскости xy поток в петли резко падает. Смещение образца более чем на половину длины петли вдоль направления внешнего поля по оси y ({>}\,0.5) приводит к смене знака его вклада. По оси x зависимость потока от координаты не столь резко выражена.
Результат, полученный выше для точечного диполя, позволяет оценить сигнал от всей ампулы с магнитными наночастицами. Для этого нужно взять интеграл в выражении (1) по координатам r_0 (объему образца). Согласно рис. 2 для получения максимального сигнала нужно поместить образец --- ампулу с точечными диполями --- в центр градиометра. Поскольку ампула цилиндрическая, удобно представить координаты содержащихся в ней диполей в цилиндрической системе координат: \widetilde r_0=(\widetilde\rho,\varphi,\widetilde z_0), переписав соответственно выражение (5). С учетом того что плотность капель n(r_0) можно выразить приближенно через отношение их количества в объеме ампулы N к объему V_a, интегральное значение среднего поля от образца будет дано выражением

В целях ограничения объема вычислений дальнейшие расчеты имеет смысл вести для определенной топологии конкретного СКВИД В работе использовался один из пары СКВИД (рис. 3), изготовленных из однослойной пленки YBa_2Cu_3O_{7-\delta} толщиной 200 нм на бикристаллической подложке SrTiO_3, размером {10\times10} мм и углом разориентации 24^\circ. Ширина джозефсоновских переходов d была выбрана равной 3 мкм, чтобы обеспечить устойчивую работу СКВИД в поле подмагничивания порядка 10^{-4} Tл. Действительно, при ширине перехода 3 мкм первый минимум критического тока появляется в поле 1.84\Phi_0/d^2={4\cdot10^{-4}} Tл [10].
Внешние размеры петель градиометра составляли 2.8 мм по оси x (lW) и 7.8 мм по оси y (W), ширина линии приемной петли c=0.4 мм, база градиометра --- расстояние между центрами приемных петель b=3 мм. Без ограничения общности, пренебрегая потерями на углах, площадь градиометра можно считать равной A=lW^2=21.8 мм^2.
Индуктивность L_S интерферометра СКВИДа, показанного на рис. 3, б, определяется формулой
Измеренная эффективная магнитометрическая площадь используемого градиометра A_\textrm{eff} была равна 0.0145 мм^2, что соответствует коэффициенту трансформации поля в поток, приложенный к интерферометру, A_\textrm{eff}^{-1}\approx140 нТл/\Phi_0. При уровне шума интерферометра {1\cdot10^{-5}} \Phi_0/Гц^{1/2} разрешение по полю в единичной полосе частот было {1.4\cdot10^{-12}} Тл/Гц^{1/2}.
Зависимость суммарного нормированного среднего поля в петлях градиометра от радиуса ампулы и высоты жидкости \bigl\langle\widetilde H_z\bigl(\widetilde R_a,\widetilde h\bigr)\bigr\rangle_V показана на рис. 4. При фиксированном объеме образца V радиус ампулы и высота жидкости в ней связаны выражением h=V/(\pi R_a^2). В соответствии с этим выражением на рисунке сплошными линиями показаны значения среднего поля для фиксированных объемов V=60 мкл (синяя линия) и V=100 мкл (красная). Видно, что при фиксированном объеме есть оптимальное соотношение радиуса и высоты образца. Точками на линиях отмечены значения, соответствующие диаметру ампулы 5 мм. Для объема 100 мкл это практически оптимум, а для объема 60 мкл диаметр можно было сделать немного больше (высоту немного меньше).

Из расчета для фиксированных объемов следует, что выбирать радиус ампулы R_a больше, чем W/4, нет смысла. Поле начинает спадать из-за отрицательного вклада частиц на краях. Диаметр ампулы может быть примерно равен или чуть меньше половины размера градиометра W. Из графика на рис. 4 также следует, что максимальные значения \bigl\langle\widetilde H_z\bigr\rangle регистрируются при {\widetilde h\approx1}. Рост поля с высотой жидкости в ампуле достаточно быстро замедляется, так что наращивать объем образца за счет увеличения смысла не имеет. Можно сказать, что оптимальный образец --- это что-то в виде кубика со стороной, чуть меньшей размера градиометра W (или цилиндр с диаметром и высотой, чуть меньшими W).
В эксперименте, следуя принятой методике регистрации броуновской релаксации магнитных наночастиц [12], измерялись реальная и квадратурная компоненты магнитной восприимчивости от образца, представляющего собой водный раствор покрытых стрептавидином магнитных наночастиц Fe_3O_4 диаметром 75 нм, в буфере с концентрацией 1 мг/мл. Объем образца в ампуле диаметром 5 мм составлял 100 мкл ({h=5} мм). Внешнее магнитное поле задавалось катушками Гельмгольца с амплитудой 7.5 мкТл в частотном интервале от 1 Гц до 1 кГц.
Результат измерений показан на рис. 5. При измерениях коэффициент трансформации сигнала с выхода СКВИДа составлял 0.7 В/\Phi_0, так что 14 мВ выходного сигнала на низких частотах соответствовали {2\cdot10^{-2}} \Phi_0 на интерферометре или полю в 12 нТл, приложенному к одной из петель интерферометра.
Оценим теперь величину сигнала по формуле (7). Из данных калибровки и сравнения данных, полученных на ВТСП СКВИД магнитометре и на измерителе магнитной восприимчивости AcreoDynoMag [13], типичное значение объемной восприимчивости \chi близко к {1\cdot10^{-2}} для магнитных жидкостей с размером наночастиц порядка 100 нм при их концентрации 1 мг/мл. Значение интеграла для образца с объемом 100 мкл для значения \widetilde{z}_a=0.25, соответствующего размерному значению z_a расстояния СКВИД--образец, равному 1 мм, в точке измерений равно 1.83 и вычисленное значение усредненного поля оказывается равным 8.5 нТл. Результат расчетов, оказавшийся всего в 1.4 раза меньше экспериментально измеренного, можно считать хорошо соответствующим экспериментальному, поскольку при юстировке ВТСП СКВИДа под стеклом криостата значение z_a, достаточно сильно влияющее на значение интеграла I, можно оценить с точностью около 30%. Дальнейшая оптимизация чувствительности безразделительной схемы иммуноанализа возможна, например, за счет использования новых схем градиометров на основе перспективных многоэлементных сверхпроводящих квантовых интерферометров [14,15,16].

Проведен анализ чувствительности безразделительной схемы иммуноанализа с использованием функционализированных магнитных наночастиц и чувствительного ВТСП СКВИД Сигнал от образца объемом 100 мкл с концентрацией 1 мг/мл в поле 7.5 нТл составляет 20 м\Phi_0, в таком случае при полосе усреднения 1 Гц для СКВИДа с уровнем шума интерферометра {1\cdot10^{-5}} \Phi_0/Гц^{1/2} отношение сигнал/шум, равное 1, будет получено в разовом измерении без накопления сигнала при концентрации 0.5 мкг/мл, что позволяет получить чувствительность в диапазоне 50 нг/мл при временных затратах в 100 с на точку.
Работа выполнена при поддержке Минобрнауки РФ (проект 14.616.21.0011, уникальный идентификатор проекта RFMEFI61614X0011) и Департамента микротехнологии и нанонауки МС 2 Чалмерского университета технологии.
Авторы работы благодарны Дагу Винклеру (Dag Winkler) и Кристеру Йохансону (Crister Johansson) за полезные дискуссии.
- Спиридонова В.А. // Биомедицинская химия. 2010. 56. C. 639.
- Tuerk C., Gold L. // Science. 1990. 249. P. 505.
- Enpuku K., Minotani T., Hotta M., Nakahodo A. // IEEE Trans. Appl. Supercond. 2001. 11. P. 661.
- Astalan P., Ahrentorp F., Johansson C. et al. // Biosens. Bioelectr. 2004. 19. P. 945.
- Tsukamoto K., Saitoh D., Suzuki N. et al. // IEEE Trans. Appl. Supercond. 2005. 15. P. 656.
- lsjen F., Magnelind P., Kalabukhov A., Winkler D. // Supercond. Sci. Technol. 2008. 21. P. 034004.
- Chukharkin M., Kalabukhov A., Schneiderman J.F. et al. // Appl. Phys. Lett. 2012. 101. P. 042602.
- Ketchen M.B. // J. Appl. Phys. 1985.58. P. 1.
- Carr C., Eulenburg A., Romans E. et al. // IEEE Trans. Appl. Supercond. 9, N 2. P. 3105.
- Rosenthal P.A., Beasley M.R., Char K. et al. // Appl. Phys. Lett. 1991. 59. P. 3482.
- Seidel P., Schrey F., Dorrer L. et al. // Supercond. Sci. Technol. 2002. 15. P. 150.
- isjen F., Schneiderman J.F., Zaborowska M. et al. // IEEE Trans. Appl. Supercond. 2009. 19, N 3. P. 848.
- The DynoMag System and the High Frequency (HF) AC Susceptometer. https://acreo.se.
- Kornev V.K., Soloviev I.I., Klenov N.V., Kolotinskiy N.V. // IEEE Trans. Appl. Supercond. 2016. 26, N 5. P. 1601205.
- Kornev V.K., Soloviev I.I., Klenov N.V., Mukhanov O.A. // Supercond. Sci. Technol. 2007. 20, N 11. P. S362.
- Kornev V.K., Soloviev I.I., Klenov N.V. et al. // IEEE Trans. Appl. Supercond. 2011. 21, N 3. P. 713.